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    ELISA克隆試劑盒

    發(fā)布時間: 2011-12-23  點擊次數(shù): 1373次

    ELISA克隆試劑盒

    1 原理:
    ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,又保留酶的活性。在測定時,受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體,也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。測定方法具有很高的敏感度(pg-ng/ml水平),并且重復(fù)性好。
    ELISA 常用的酶和底物
    辣根過氧化物酶,底物為OPD, 深桔 ,檢測波長492nm
    TMB,藍(lán)綠色,檢測波長450nm
    堿性磷酸酶,底物為PNPP(對-消基苯磷酸酯),
    檢測波長405nm
    ELISA各步驟的反應(yīng)時間
    包被:24-36h,蛋白濃度為1-5ug/ml
    封閉:37ºC 2h 或4ºC過夜(3%BSA)
    樣本反應(yīng)時間:37ºC 45min-1h
    酶標(biāo)抗體反應(yīng)時間: 37ºC 45min-1h
    顯色時間:15min(避光)
    設(shè)對照
    可以一次包被多塊板,凍存?zhèn)溆?br />2 類型
    (1)間接法測抗體
    間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體,檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體,故稱為間接法。
    常用于臨床血清中自身抗體的檢測,以及雜交瘤上清特異性抗體的篩選。如血清中PDCD5自身抗體的檢測。

    (2) 雙抗體夾心法測抗原
    是檢測抗原zui常用的方法。
    只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體,就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。
    常用的組合:單克隆抗體+多克隆抗體
    單克隆抗體+單克隆抗體
    后一組合是兩種單克隆抗體針對抗原上不同的相距較遠(yuǎn)的兩個抗原決定簇,分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。
    用途:測定二價或二價以上的大分子抗原,但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原,因其不能形成兩位點夾心。例如各種細(xì)胞因子的檢測。

    雙抗體夾心法測抗原的方法:
    捕獲抗體包被→封閉(3%BSA)→待測抗原→洗滌(含0.1%Tween的PBS)→酶標(biāo)單抗或多抗→洗滌→顯色→檢測
    (3)競爭法測抗原
    1)抗體固相測抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點,因此不能用雙抗體夾心法進行測定,可以采用競爭法模式。
    其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多,結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少,zui后的顯色也愈淺。
     

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